以下是關于超微量分光光度計校準方式的詳細解析，涵蓋核心步驟、技術要點及注意事項：
一、儀器自校準功能
1. 原理與目的
超微量分光光度計通常內置自校準程序，通過儀器自帶的標準參數(如暗電流校正、光源強度補償)對光學系統進行初始化標定。自校準可快速修正電子漂移、光源老化等引起的偏差，是日常維護的基礎步驟。
2. 操作步驟
- 進入儀器菜單，選擇“自校準”或“性能驗證”模式；
- 按提示執行空白測量(如空氣或純水作為參比)；
- 儀器自動調整至出廠預設參數，并生成校準報告。
3. 局限性
自校準無法糾正波長偏移或光路物理變化(如光纖位移)，需結合其他方法定期驗證。
二、外部標準溶液校準
1. 適用場景
當儀器用于定量分析(如核酸、蛋白濃度測定)時，需通過標準溶液驗證吸光度準確性。常用標準物質包括：
- 霍姆斯緩沖液(Horseradish Peroxidase, HRP)：用于紫外區(230 nm、260 nm、280 nm)校準；
- 中性密度濾光片：驗證吸光度線性范圍(0-4 OD)；
- NIST追溯標準溶液(如重鉻酸鉀溶液)：用于多波長交叉驗證。
2. 操作要點
- 液柱形成：超微量儀依賴基座檢測模式，需用移液槍精確滴加0.3-2 μL標準液，形成穩定液柱(光程0.05-0.5 mm)；
- 多點校準：在目標波長(如260 nm測RNA)下測量不同濃度標準品，繪制標準曲線，計算儀器線性相關系數(R²>0.995為合格)；
- 空白對照：使用同批次溶劑(如超純水)作為參比，避免溶劑雜質干擾。
三、波長校準
1. 必要性
波長準確性直接影響定性分析(如特征吸收峰識別)。超微量儀的氙燈光源或LED光源可能發生波長漂移，需定期校驗。
2. 校準方法
- 汞燈特征譜線法：利用汞燈在253.6 nm、296.7 nm等處的尖銳吸收峰，對比儀器顯示波長與實際峰值偏差(應<±1 nm)；
- Horia溶液法：通過鈥玻璃在可見光區的多條特征吸收峰(如486 nm、536 nm)進行多點校準；
- 軟件校準：部分機型支持自動掃描標準濾光片，通過算法修正波長偏移。
四、穩定性與重復性檢測
1. 短期穩定性
- 連續測量同一標準樣品(如1 mg/mL BSA溶液)至少6次，記錄吸光度值(如280 nm下誤差應<±0.005 OD)；
- 檢查基線噪聲(通常要求<0.002 OD)以評估光路穩定性。
2. 長期穩定性
- 每月進行一次全波長范圍(200-1000 nm)的基線掃描，觀察雜散光和波長重復性；
- 使用標準溶液周期性驗證(如每周一次)，記錄偏差趨勢。
五、特殊注意事項
1. 基座清潔與維護
- 每次使用后用拭鏡紙擦拭基座，防止殘留蛋白或鹽結晶影響液柱形成；
- 定期檢查光纖探頭是否磨損，避免光損失。
2. 環境控制
- 實驗室溫度需控制在20-25℃，濕度<60%，避免冷凝水干擾光學系統；
- 避開強電磁場(如離心機、微波爐)，防止信號噪聲。
3. 溯源性與合規性
- 校準標準物質需具備NIST或ISO認證，確保量值傳遞可靠性；
- 若用于臨床診斷或質檢，需符合行業規范(如CLSI標準或藥典要求)。
